Análise de dados de sequenciamento de RNA voltados à comparação de expressão gênica visando a um melhor entendimento dos mecanismos de resistência aos antimoniais

A origem do que hoje chamamos de Sequenciamento de Nova Geração foi impulsionada pelo sequenciamento do genoma humano e pela necessidade de inovações técnicas, tecnológicas e computacionais que reduzissem os custos e o tempo de análise. Essa necessidade possibilitou de uma maneira sem precedentes o aumento dos estudos de genômica e transcriptômica. O melhor entendimento do transcriptoma de um organismo é essencial para identificar e interpretar como a maquinaria gênica atua nos processos biológicos. Um grupo de organismos de grande interesse em saúde pública e causadores do conjunto de doenças negligenciadas conhecidas como leishmanioses são os parasitos protozoários do gênero Leishmania. Anualmente, estima-se que aproximadamente 300 mil novos casos e 20 mil mortes relacionadas à leishmaniose visceral são registrados. O tratamento das leishmanioses é problemático devido principalmente à alta toxicidade dos antimoniais pentavalentes e o surgimento de parasitos resistentes a esses compostos. Por fim, considerando que esses parasitas são agentes etiológicos de uma importante doença negligenciada, pesquisas que tragam novas perspectivas para o entendimento dos mecanismos de resistência aos compostos antimoniais são de particular importância. Neste contexto, analisamos comparativamente o transcriptoma de duas linhagens de Leishmania infantum (MHOM/BR/74/PP75), uma selvagem (LiWTS) e outra resistente ao antimônio trivalente (SbIII) (LiSbR) com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos que possam estar associados aos mecanismos de resistência

Para tanto, utilizamos a plataforma de sequenciamento Illumina HiSeq 2000 para o sequenciamento das amostras. Parte do processo analítico envolveu a reanotação funcional dos genes de L. infantum JPCM5 que foi utilizada como cepa referência para o processo de mapeamento das leituras geradas. As amostras foram avaliadas quanto à sua qualidade com os programas Prinseq e FastQC. As sequências adaptadoras e de baixa qualidade foram removidas utilizando o Trimmomatic. O TopHat2 foi utilizado para o processo de mapeamento das leituras no genoma de L. infantum JPCM5 e o DESeq2 para a realização das análises estatísticas

Esse pipeline analítico e a busca por genes que possuíssem um p-valor ajustado 1.2 possibilitaram a identificação de 719 genes diferencialmente expressos (699 com regulação positiva e 20 com regulação negativa) quando comparamos a linhagem resistente tratada 0.06 mg de SbIII (LiSbR 0.06) com a linhagem LiWTS , e 779 genes diferencialmente expressos (749 com regulação positiva e 30 com regulação negativa) quando comparamos as linhagens LiSbR 0.06 e LiWTS 0.06, ambas tratadas com baixa dose de antimônio. No entanto, não observamos nenhum gene diferencialmente expresso quando comparamos as linhagens selvagens tratadas e não tratadas com SbIII, indicando ausência de transcrição gênica diferencial devido ao estresse da droga. Além disso, realizamos a classificação funcional dos produtos proteicos destes genes de acordo com o Pfam. Observamos que grande parte desses genes codificam chaperonas e proteínas relacionadas a estresse, transportadores, proteínas estruturais, proteínas envolvidas nos processos de ubiquitinação e processamento de DNA e RNA, enzimas metabólicas (envolvidas nos processos de proteólise, metabolismo de ácidos graxos, carboidratos e proteínas, entre outras), controle do ciclo celular, proteínas que atuam na mediação da interação com outras proteínas, proteínas com função desconhecida na biologia de Leishmania spp. e proteínas hipotéticas. Neste estudo observamos um conjunto de genes diferencialmente expressos em L. infantum evidenciando que o fenômeno de resistência desse parasito aos compostos antimoniais é multigênico e complexo

Variantes no gene MBL2 codificador da Lectina Ligante de Manose (MBL): implicações na leishmaniose visceral humana / Genetic variants of MBL2 encoding Mannose-binding lectin (MBL): implications in human visceral leishmaniasis

A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma doença endêmica, crônica, grave e de alta letalidade se não tratada. Os estudos apontam a proteína Lectina Ligante de Manose (MBL), codificada pelo gene MBL2, como uma peça-chave na imunidade inata, dada a sua função no reconhecimento microbiano, na eliminação, inflamação e morte celular. Neste trabalho realizamos um estudo do tipo caso-controle que teve como objetivo investigar a associação entre variantes no gene MBL2 e a suscetibilidade à LV em indivíduos residentes em áreas endêmicas da Ilha de São Luís-MA. A amostra foi constituída por 322 indivíduos, sendo 161 casos com LV, não aparentados, de ambos os sexos, residentes em áreas endêmicas da doença na Ilha de São Luís e 161 controles saudáveis, não infectados e não aparentados da mesma região. A identificação dos casos de LV se deu por meio do contato constante com os principais hospitais e ambulatórios de referência para a doença na cidade. Também foram feitas buscas de pacientes com LV em ambiente domiciliar, a partir de registros da FUNASA-MA. A análise molecular consistiu na genotipagem de 6 variantes localizadas na região promotora [posições -550 (C>G), -221(G>C), +4(C>T)] e codificadora [códons 52 (C>T), 54 (G>A) e 57 (G>A)] do gene MBL2, através da reação em cadeia da polimerase e sequenciamento automático. A dosagem da proteína MBL no soro foi realizada pelo teste de ELISA. Verificamos que os fenótipos MBL dependem do conjunto de alelos presentes no gene MBL2, sendo nítido o efeito que as variantes defectivas causam nos níveis da proteína. Não encontramos diferença significativa entre casos e controles em relação à distribuição dos genótipos MBL2 e dos níveis séricos de MBL. As frequências alélicas das variantes exônicas na amostra total mostram que o alelo A é o mais comum (74,8%) e que os alelos defectivos (B, C e D) se encontram principalmente em heterozigose (36,6%), o que reforça a ideia de que alelos MBL2 defectivos são mantidos na população ...

Visceral leishmaniasis (VL), also known as kalazar, is an endemic, chronic, severe and highly lethal disease when not treated. Studies have shown that the protein Mannose-biding lectin (MBL), encoded by the gene MBL2, is the major player in innate immune system due its role in microbial recognition, elimination and inflammation as well as in the cell death. In the current work, we conducted a case-control study which aimed to investigate the association between variants in the gene MBL2 and the susceptibility to VL in individuals living in endemic areas of the São Luís - MA. 322 individuals participated in this study. Of these, 161 were VL cases being unrelated individuals of both sexes, and inhabitants from endemic areas of the disease in São Luís. The other 161 individuals were uninfected healthy controls, being unrelated and from the same region. The identification of VL cases occurred by visiting reference hospitals and clinics in the city. VL patients were identified in the household environment through the records of FUNASA-MA. Molecular analysis consisted in genotyping six variants located in the promoter region [positions -550 (C> G), -221 (G> C), +4 (C> T)] and coding region [codons 52 (C> T), 54 (G> A) and 57 (G> A)] of the MBL2 gene by polymerase chain reaction and automated DNA sequencing. The concentrations of MBL protein in the serum was performed by ELISA. We found that MBL phenotypes depend on the number of alleles present in the gene MBL2, being clear the consequence of the defective variants in the protein levels. There was no significant difference between cases and controls regarding the distribution of MBL2 genotypes and MBL serum levels. The allele frequencies of exon variants in the overall sample showed that the A allele is the most common (74.8%) and that the defective alleles (B, C and D) are mainly heterozygous (36.6%). This highlights the idea that defective MBL2 alleles are maintained in the population to confer selective ...

[Prevalence of IL18-607A/C polymorphism in patients with visceral leishmaniasis]

Visceral leishmaniasis [VL] is a parasitic disease caused by a protozoan of Leishmania genus and in Iran by Leishmania infantum. The protective immune response against VL is cellular immunity through Th1 CD4+, which dominant chemokiens are IL12, IFN-alpha and IL18 and lead to Th1 response. Single nucleotide polymorphism [SNP] on IL-18 gene and its relation to IL18 levels in blood and IL18 function have been studied in many inflammatory diseases such as Behcect's disease and tuberculosis. According to the important role of IL-18 in immunity against visceral leishmaniasis, this study was conducted to demonstrate the prevalence of genotypes on-607A/C in promoter region of IL-18 gene. This descriptive and cross-sectional study was done on 91 pateints with confirmed VL, 105 healthy sero-negative controls and 78 seropositive controls during 1999-2009. Salting out method was used to extract DNA and ARMS-PCR was used to determine the genotype of-607A/C allele of individuals. Statistical analysis of genotypes was performed using Chi-Square test. According to the results,-607C/C was the dominant genotype among the groups [35.8%]. Distribution of genotypes among groups had not any significant difference. The lowest genotype among healthy sero-positive and patients were-607A/C and-607A/A, respectively. Statistical analysis of distribution of genotypes, did not reveal any significant difference among groups. The dominant genotypes of VL patients, healthy sero-negatives and healthy seropositives were-607C/C [38.5%],-607A/C [37.1%] and-607C/C [35.9%] respectively

Detecção de DNA de Leishmania spp. em sangue periférico para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana

Avaliou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores que amplificam a região conservada do kDNA do mini-círculo mitocondrial de Leishmania spp. para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) em sangue periférico. O limite de detecção foi de 4,5 atg de DNA total de Leishmania (Leishmania) chagasi (equivalente a 4,5x10-5 parasito). kDNA de Leishmania spp. foi detectado no sangue periférico de 47 entre 53 (89 porcento) pacientes portadores de LV. Não se detectou DNA de Leishmania spp. no sangue periférico de 15 voluntários não-expostos (Detection of circulating Leishmania chagasi DNA for the non-invasive diagnosis of human infection, Trans Royal Soc. Trop. Med. Hyg, in press). A presença de DNA circulante de Leishmania spp. antes, durante e 61 a 259 dias após o tratamento da LV foi avaliada em 20 pacientes. Dezessete deles (85 porcento) apresentaram PCR positivo antes do tratamento. Em 16 (94 porcento) entre este 17 a DNA deixou de ser detectado até a primeira semana após o termino. Apenas uma paciente apresentou PCR positivo durante todo tempo de acompanhamento (259 dias), apesar de recuperação clínica completa (Clearance of circulating Leishmania kDNA after treatment of human visceral leishmaniasis,enviado para publicação). Um oligonucleotídeo Leishmania donovani complexo-específico e, complementar à uma seqüência interna da região conservada do mini-círculo, foi desenhado e utilizado como iniciador reverso adicional ao par de iniciadores que amplificam a região conservada, em ensaio “PCR multiplex”

Os isolados de referência pertencentes ao complexo Leishmania donovani geraram os produtos complexo e gênero-específico, também identificados em sangue periférico de 20 pacientes com LV. Isolados de outros complexos apresentaram somente o produto gênero-específico (Single step multiplex-kDNA-PCR for detection of Leishmania donovani complex in human peripheral blood samples, enviado para publicação). É descrita a caracterização de L. (L.) chagasi isolada de lesão cutânea de um paciente portador de co-infecção Leishmania/HIV com manifestações viscerais e cutâneas, através de eletroforese enzímática e por análise de polimorfismos em fragmentos de DNA (Identification of Leishmania chagasi from skin in Leishmania/HIV co-infection: a case report)

Detecção de DNA de Leishmania spp. em sangue periférico para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana / Detection of DNA of Leishmania spp. in peripheral blood for diagnosis of human visceral leishmaniasis

Avaliou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores que amplificam a região conservada do kDNA do mini-círculo mitocondrial de Leishmania spp. para o diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) em sangue periférico. O limite de detecção foi de 4,5 atg de DNA total de Leishmania (Leishmania) chagasi (equivalente a 4,5x10-5 parasito). kDNA de Leishmania spp. foi detectado no sangue periférico de 47 entre 53 (89 por cento) pacientes portadores de LV. Não se detectou DNA de Leishmania spp. no sangue periférico de 15 voluntários não-expostos (Detection of circulating Leishmania chagasi DNA for the non-invasive diagnosis of human infection, Trans Royal Soc. Trop. Med. Hyg, in press). A presença de DNA circulante de Leishmania spp. antes, durante e 61 a 259 dias após o tratamento da LV foi avaliada em 20 pacientes. Dezessete deles (85 por cento) apresentaram PCR positivo antes do tratamento. Em 16 (94 por cento) entre este 17 a DNA deixou de ser detectado até a primeira semana após o termino. Apenas uma paciente apresentou PCR positivo durante todo tempo de acompanhamento (259 dias), apesar de recuperação clínica completa (Clearance of circulating Leishmania kDNA after treatment of human visceral leishmaniasis, enviado para publicação). Um oligonucleotídeo Leishmania donovani complexo-específico e, complementar à uma seqüência interna da região conservada do mini-círculo, foi desenhado e utilizado como iniciador reverso adicional ao par de iniciadores que amplificam a região conservada, em ensaio "PCR multiplex". Os isolados de referência pertencentes ao complexo Leishmania donovani geraram os produtos complexo e gênero-específico, também identificados em sangue periférico de 20 pacientes com LV. Isolados de outros complexos apresentaram somente o produto gênero-específico (Single step multiplex-kDNA-PCR for detection of Leishmania donovani complex in human peripheral blood samples, enviado para publicação). É descrita a caracterização de L. (L.) chagasi isolada de lesão cutânea de um paciente portador de co-infecção Leishmania/HIV com manifestações viscerais e cutâneas, através de eletroforese enzimática e por análise de polimorfismos em fragmentos de DNA (Identification of Leishmania chagasi from skin in Leishmania/HIV co-infection: a case report).

Genetic causes involved in Leishmania Chagasi infection innortheastern: Brazil

A sample of 502 individuals from 94 families from Jacobina, State of Bahia, Brazil, was investigated to determine the causal mechanisms involved in Leishmania chagasi (the causal agent of visceral leishmaniasis in the American hemisphere) infection, as measured by the intradermic reaction to antigens derived from this parasite, using complex segregation analyses. The results showed evidence of a major genetic mechanism acting on infection, with a frequency of a recessive (or additive) susceptibility gene (q) of approximately 0.45. A small multifactorial component (H = 0.29) acting in conjunction with a major recessive gene (q = 0.37) is not ruled out as a concomitant causative factor.

Leishmaniose visceral: avaliação dos fatores de risco genético (Sistema HLA e Sistema Sanguíneo ABO_Rh): aspectos imnulógicos e outros fatores de risco / Visceral leishmaniasis: assessment of genetic risk factors (HLA system and system ABO blood-Rh): immunological aspects and other risk factors

Em quinze famílias com multicasos de leishmaniose visceral americana (LVA),provenientes de uma área endêmica de Teresina (Piauí), foi estudada a concentração familiar da infecção por Leishmania chagasi, bem como a identificação de um provável fator genético que pudesse estar conferindo susceptibilidade e/ou resistência à L V A. Estas famílias foram selecionadas a partir de casos-índice, com uma história atual ou passada da doença, diagnosticada pela demonstração do parasita por punção de medula óssea. Como controle negativo, vinte e uma famílias, sem casos de história da doença, residentes de uma mesma área endêmica. As trinta e seis famílias foram classificadas, em três grupos,de acordo com os achados clínicos e parâmetros imunológicos (teste intradérmico - lDRM e sorológico - lFI): a) 15 famílias com casos de história da doença; b) 10 famílias contendo casos de infecção sem doença; e c) 10 famílias sem casos de infecção ou doença. Todos estes grupos foram acompanhados por três anos. Através da análise de pares de irmãos, pôde-se observar que o caráter familiar da infecção e da doença não era casual, sugerindo que fatores genéticos deveriam estar atuando na resposta do hospedeiro ao parasita. Uma única espécie de Leishmania era responsável pelas infecção e doença, nessa área, e outros fatores ambientais atuavam de forma semelhante, nos três grupos de famílias. A homogeneidade da freqüência dos indivíduos, nestes grupos, também, foi observada em relação à raça (cor), ao sexo e à idade. Não foi observada uma associação entre a raça e a infecção por L. chagasi per se, ou entre os seus diferentes tipos de manifestações. Entretanto, observou-se uma maior freqüência da doença entre crianças até nove anos de idade e do sexo masculino, em relação às do sexo feminino; provavelmente devido a maior prevalência de assintomáticos resistentes entre os indivíduos do sexo feminino. Os grupos sangüíneos (ABO-Rh) foram determinados em todos os membros das trinta e seis famílias estudadas. A identificação de antígenos-HLA, classes l e II (teste de microcitotoxicidade) e classe lII (reação de imunoeletroforese ou focalização isoelétrica) foi feita em doze famílias informativas. Os resultados não evidenciaram correlação entre os grupos sangüíneos ABO-Rh e a infecção ou a doença por L. chagasi, embora a prole com o fenótipo A apresente um risco 2,96 vezes maior de adquirir a infecção por L.chagasi. Não foram, também, observados genes ligados ao Sistema HLA que conferissem susceptibilidade e/ou resistência à LVA per se. A falta de evidências da correlação entre o Sistema HLA e os diferentes tipos de manifestações da infecção pelo parasita, bem como a resposta imune (celular e humoral) do hospedeiro, merecem estudos mais aprofundados; visto que, os tipos de manifestações da infecção por L. chagasi, conhecidamente, é mediada pela resposta imune, a qual é regulada pelo CMH (classe l e II) entre outros fatores genéticos.